研究目的
提出一种优化的方案，将体视学数据采集与多重免疫荧光技术相结合，以最大化神经科学研究的解释力和效率。
研究成果
该协议成功地将体视学数据采集与多重免疫荧光技术相结合，在低抽样误差和高评估者内可靠性的前提下，为细胞群体提供了可靠的估算值。它为神经科学家提供了一种宝贵的工具，以最大化其研究的解释力和效率。
研究不足
该方案可能需要针对不同抗体和组织类型进行优化。光漂白可能是个挑战，荧光团和封片剂的选择对最小化此问题至关重要。
1：实验设计与方法选择：
本方案整合体视学数据采集与多重免疫荧光技术，采用针对蓝光（DAPI）、绿光（FITC）和远红光（CY5）通道优化的宽场落射荧光滤光片组。包含高温抗原修复及使用连接稳定荧光团的二抗。
2：样本选择与数据来源：
使用出生后第10天大鼠大脑皮层，估算Ctip2免疫反应性皮层下投射神经元与NeuN免疫反应性神经元的数量。
3：实验设备与材料清单：
包括冷冻切片机或振动切片机、旋转仪、磁力搅拌器、电饭煲、各类免疫标记试剂溶液及体视学软件套装。
4：实验流程与操作步骤：
详述组织处理、免疫标记及光学分割法数据采集的完整流程，涵盖切片、抗原修复、封闭、一抗二抗孵育及封片等环节。
5：数据分析方法：
采用光学分割法进行细胞数量数值估算，通过误差评估与观察者内可靠性测试验证参数设定的有效性。
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Stereology software suite
Stereo Investigator
MBF Bioscience
Used for stereological data collection and analysis.
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Microscope
BX61
Olympus
Used for fluorescence imaging and stereological sampling.
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High magnification oil lens
60× PlanApo
Olympus
Used for fine optical sectioning during stereological sampling.
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Low magnification air lens
2× PlanApo
Olympus
Used for delineating the region of interest at low power.
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Fluorescence illumination system
Lumen 200
Prior
Provides illumination for fluorescence imaging.
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Monochrome video camera
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Hamamatsu
Transmits fluorescence signal to a workstation for visualization.
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Immersion oil
MOIL-30
Olympus
Used with high magnification oil lens for fine optical sectioning.
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Cryostat
Used for cryosectioning tissue.
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Rotator
4630
Barnstead Lab-Line
Used for rotating samples during immunolabeling.
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Stir plate
12365-382
VWR
Used for stirring solutions.
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Rice steamer
5712
Oster
Used for antigen retrieval.
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Filter Cubes
DAPI, FITC, TRITC, and Cy5 filter sets
Chroma
Used for viewing multiple fluorescence channels.
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Automated stage
Prior
Used for systematic sampling during stereological data collection.
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Microcator
Heidenhain
Used for measuring tissue thickness during stereological sampling.
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