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利用SYN1和CaMKII启动子表达的通道视紫红质-2对二维和三维培养体系中iPS细胞来源神经元的光遗传学控制

DOI：10.1002/term.2786 期刊：Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine 出版年份：2018 更新时间：2025-09-23 15:19:57
摘要： 在三维（3D）环境中开发光遗传学可控的人类神经网络模型，可提供一个与生理相关或模拟人脑的研究系统。通过慢病毒和细胞类型特异性启动子，将通道视紫红质-2（ChR2）转导至人诱导多能干细胞（hiPSCs）来源的神经祖细胞（Axol），从而生成光敏神经元。经神经分化后，获得由人iPSCs来源的皮层神经元、星形胶质细胞和祖细胞组成的混合群体（Axol-ChR2）。利用泛神经元启动子突触蛋白-1（SYN1）和兴奋性神经元特异性启动子钙调蛋白激酶II（CaMKII）驱动报告基因表达，以评估靶细胞的分化状态。采用流式细胞术和免疫荧光染色评估分化后Axol-ChR2细胞中ChR2的表达及各亚群特征。将这些细胞从二维培养转移至经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）和小分子（Y-27632）功能化的三维海藻酸盐水凝胶中。对改良的RGD-海藻酸盐水凝胶进行物理特性表征及细胞活性评估，以建立适用于hPSCs和神经细胞的通用3D培养体系。在细胞包封前，采用钙成像技术研究Axol-ChR2细胞和原代神经元的神经网络活动。结果表明，通过CaMKII和SYN1启动子表达ChR2均成功实现了功能性活动。该RGD-海藻酸盐水凝胶体系支持分化后Axol-ChR2细胞的生长，同时在光刺激下可检测到ChR2表达，从而实现对三维人类神经网络的精准无创调控。
作者： Si-Yuen Lee，Julian H. George，David A. Nagel，Hua Ye，Gray Kueberuwa，Leonard W. Seymour
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研究概述 实验方案 设备清单

研究目的

为了确定在光遗传工程改造、分化并封装于功能化藻酸盐水凝胶（RGD+ROCKi）后，用于hiPSC衍生神经元（Axol-ChR2）中ChR2表达的最佳启动子类型。我们还检验了这些细胞不仅在二维培养中，而且在三维培养中能否存活并成熟为对光刺激有反应的活性神经元/神经网络。

研究成果

该研究成功生成并光遗传学改造了人诱导多能干细胞(hiPSC)来源的神经细胞。通过神经元特异性启动子(CaMKII和SYN1)高效驱动ChR2表达，分别表明存在兴奋性和抑制性神经元。在透明RGD-藻酸盐水凝胶中，利用钙成像技术可检测到具有活性的ChR2阳性神经元。这为未来药物筛选、非侵入性重复功能分析及神经调控建立了一个功能性三维神经网络模型。

研究不足

该研究承认从人多能干细胞产生功能性神经元存在挑战，且神经成熟需要更长的培养时间。海藻酸盐水凝胶包封可能影响钙活性和光穿透，这需要进一步研究。

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