研究目的
采用基于荧光共振能量转移(FRET)的高通量筛选方法并结合构效关系研究，旨在从新月柄杆菌中鉴定出二鸟苷酸环化酶DgcA的合成小分子调节剂，以开发控制生物膜形成和理解环二鸟苷酸(c-di-GMP)信号传导的工具。
研究成果
通过基于FRET的高通量筛选和构效关系研究，该研究成功鉴定出对DgcA具有多样效应（包括抑制剂、沉默调节剂和激活剂）的小分子调节剂。这些化合物为探究环二鸟苷酸信号网络提供了新型化学骨架，并有望作为抗生物膜药物的先导化合物。研究结果揭示了二鸟苷酸环化酶中变构调节的复杂性，以及详细作用机制研究的重要性。
研究不足
该研究仅限于使用纯化的DgcA酶进行体外生化实验；未充分探究其在体内的有效性及对其他DGC酶的特异性。这些化合物可能存在稳定性问题（例如酯键易水解）和潜在细胞毒性。高通量筛选可能因自发荧光或其他干扰而遗漏某些化合物。若要用于药物开发，还需进一步优化。
1：实验设计与方法选择：
开发了基于FRET的生化高通量筛?。℉TS）检测法来监测c-di-GMP生成。该检测采用由PilZ蛋白YcgR的c-di-GMP结合域与mCYPet、mYPet荧光蛋白标记组成的FRET生物传感器。c-di-GMP结合会改变FRET效率，从而实现其浓度检测。实验在384孔板中进行，反应体积为20微升。
2：样本选择与数据来源：
以新月柄杆菌的DgcA酶作为模型酶。筛选了来自Asinex公司、Enamine公司和Life Chemicals等供应商的27,502种市售小分子化学库。
3：实验设备与材料清单：
设备包括Hamilton公司的PlateMate Plus液体处理仪、Biotek公司的Microflo孔板分液器、康宁低容量384孔黑色平底聚苯乙烯微孔板（货号3821BC），以及配备特定滤光片的PerkinElmer Envision 2104荧光读板机。蛋白质在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达并通过亲和层析纯化。试剂包含GTP、c-di-GMP、DMSO及各类缓冲液。
4：实验流程与操作步骤：
筛选时将DgcA酶与化合物（200纳升，5毫克/毫升DMSO溶液）在384孔板中预孵育。添加FRET生物传感器和GTP底物前后测定荧光发射值。孵育3小时后于470和535纳米波长测量FRET信号。筛选标准为c-di-GMP浓度低于300纳摩尔、双复孔结果一致且自发荧光低。后续实验包括合成衍生物的剂量反应（IC50）测定和构效关系（SAR）研究。
5：数据分析方法：
数据通过Excel处理。FRET比值计算为Em527纳米/Em470纳米。采用Z'因子进行检测质量控制。IC50和AC50值通过Hill方程拟合。初始速率根据米氏动力学确定。
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