研究目的
描述一种结合活细胞荧光显微镜和透射电子显微镜来研究自噬体的方法，该方法能够揭示三维超微结构细节，而这些细节是其他任何方法都无法获得的。
研究成果
该协议成功结合了活细胞成像与电子显微镜技术，为自噬体提供了详细的超微结构洞察，克服了单一显微技术的局限性。核心发现包括能够将动态荧光数据与高分辨率电镜图像相关联，揭示膜接触位点及细胞器连接。该方法对自噬研究具有重要意义，可全面呈现细胞过程。未来研究应聚焦于优化关联方法并拓展至其他细胞类型或条件。
研究不足
技术限制包括：MatTek培养皿可能存在的问题（如网格错位或模糊）、电子显微镜图像中小荧光细胞器追踪困难，以及包埋过程中防止细胞干燥的关键步骤。应用限制：每个培养皿仅能使用一个网格区域进行电镜分析，这限制了可检测的细胞数量。优化方向：改进培养皿质量、优化关联软件，以及采用MiniSOG或荧光微球等替代标记物以提高准确性。
1：实验设计与方法选择：
本方案采用关联光镜与电镜技术（CLEM）研究自噬体，通过活细胞成像观察动态过程，利用电子显微镜获取超微结构细节。理论模型包括用荧光显微镜定位蛋白质，用电镜观察膜形态。
2：样本选择与数据来源：
使用稳定表达mRFP-GFP-LC3的HeLa细胞和稳定表达ATG13的HEK293细胞，基于其自噬标志物表达进行筛选。细胞接种于网格化玻璃底培养皿以方便关联定位。
3：实验设备与材料清单：
包含网格化玻璃底细胞培养皿（MatTek P35G-1.5-14-CGRD）、聚赖氨酸、饥饿培养基、戊二醛、HEPES缓冲液、四氧化锇、醋酸铀、乙醇、BEEM包埋胶囊、包埋树脂、二甲胂酸钠缓冲液、单槽铜网、柠檬酸铅、相差显微镜、共聚焦显微镜、超薄切片机、立体显微镜和电子显微镜。
4：5-14-CGRD）、聚赖氨酸、饥饿培养基、戊二醛、HEPES缓冲液、四氧化锇、醋酸铀、乙醇、BEEM包埋胶囊、包埋树脂、二甲胂酸钠缓冲液、单槽铜网、柠檬酸铅、相差显微镜、共聚焦显微镜、超薄切片机、立体显微镜和电子显微镜。 实验流程与操作步骤：
4. 实验流程与操作步骤：包括培养皿聚赖氨酸包被、细胞接种、共聚焦显微镜活细胞成像、多聚甲醛与戊二醛固定、四氧化锇与醋酸铀后固定、乙醇梯度脱水、树脂包埋、聚合反应、树脂块修整、金刚石刀超薄切片、切片染色，以及通过手动方法或ImageJ软件TrakEM2?？楣亓饩涤氲缇低枷?。
5：数据分析方法：
通过叠加荧光/相差图像与电镜图像进行关联定位，使用形态学标记或软件工具。未指定统计技术，分析基于图像配准和结构识别的定性评估。
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获取完整内容-
Glutaraldehyde
G5882
Sigma-Aldrich
Fixative for electron microscopy, used to preserve cellular structures.
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Gridded glass-bottom cell culture dishes
P35G-1.5-14-CGRD
MatTek
Used for cell culture and imaging, with a grid to facilitate location of cells in microscopy.
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Polylysine
P4707
Sigma
Coating agent to improve cell adhesion to culture dishes.
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Osmium tetroxide
19140
Electron Microscopy Sciences
Post-fixation agent to add contrast to membranes in electron microscopy.
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Uranyl acetate
22400
Electron Microscopy Sciences
Staining agent to enhance contrast in electron microscopy sections.
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BEEM Embedding Capsules
70000-B
Electron Microscopy Sciences
Used for embedding cells in resin for electron microscopy sectioning.
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Embedding resin
T028
TAAB
Resin for embedding samples to prepare thin sections for electron microscopy.
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Sodium cacodylate buffer
12300
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Buffer used in fixation and washing steps for electron microscopy.
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Single-slot copper grids
G2010-Cu
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Grids for holding thin sections in electron microscopy.
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Lead citrate
17800
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Staining agent for electron microscopy sections to enhance contrast.
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