研究目的
要确定NADH和FAD的自体荧光能否用于无创监测伤口愈合在体内的动态变化过程，并判断光学氧化还原比是否能作为伤口愈合受损的定量生物标志物。
研究成果
该研究成功证明，体内多光子显微镜可监测皮肤伤口的代谢变化，其中光学氧化还原比作为糖尿病小鼠愈合受损的敏感生物标志物。这种无创方法能定量分析角质形成细胞的增殖与代谢情况，为伤口护理诊断和治疗监测的临床应用提供了可能。
研究不足
该研究仅限于小鼠模型，可能无法完全适用于人类伤口愈合。FLIM因采集时间长而产生的运动伪影可能影响数据质量。光学氧化还原比测量可能受到其他未充分考虑的生色团影响，且该方法需要专业设备，在临床环境中尚未广泛普及。
1：实验设计与方法选择：
本研究采用高速容积多光子显微镜（MPM）成像及图像处理技术，在10天内生成糖尿病与非糖尿病小鼠全层切除伤口的代谢三维图谱。方法包括体内MPM用于自体荧光成像、荧光寿命成像（FLIM），以及离体组织免疫组化分析。
2：样本选择与数据来源：
使用6周龄雄性C57BL/6J小鼠，分为链脲佐菌素诱导的糖尿病组和对照组。通过无菌活检打孔器制造伤口，于伤后第1、3、5、7和10天进行成像。
3：7和10天进行成像。 实验设备与材料清单：
3. 实验设备与材料清单：布鲁克Ultima Investigator激光扫描显微镜、Ti:蓝宝石激光器（Spectra-Physics）、20倍1.0数值孔径水浸物镜（奥林巴斯）、GaAsP光电倍增管（滨松）、滤光片（Chroma）、ReliOn血糖监测仪、Tegaderm敷料、Tissue-Tek OCT包埋剂、Ki67抗体、DAPI染料及其他试剂。
4：0数值孔径水浸物镜（奥林巴斯）、GaAsP光电倍增管（滨松）、滤光片（Chroma）、ReliOn血糖监测仪、Tegaderm敷料、Tissue-Tek OCT包埋剂、Ki67抗体、DAPI染料及其他试剂。 实验流程与操作规范：
4. 实验流程与操作规范：小鼠麻醉后在伤口边缘进行MPM成像?？焖倩袢轴堆栈以减少运动伪影。图像处理包含配准、平均化和归一化。采集FLIM数据用于NADH寿命分析。制备离体切片进行HE染色和Ki67免疫标记。
5：数据分析方法：
统计分析采用双因素方差分析（Tukey HSD检验）和皮尔逊相关系数。图像处理与分析通过MATLAB和SPCImage软件完成。
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Bruker Ultima Investigator
Ultima Investigator
Bruker
Laser scanning microscope used for multiphoton microscopy imaging.
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Water-immersion objective
20x, 1.0 NA
Olympus
Microscope objective for in vivo imaging with high numerical aperture.
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GaAsP photomultiplier tubes
H10770PB-40
Hamamatsu
Detectors for collecting fluorescence emission signals.
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SPCImage software
6.4
Becker & Hickl Gmbh
Software for processing fluorescence lifetime imaging data.
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Ti:sapphire laser
Not specified
Spectra-Physics
Laser source for multiphoton excitation in microscopy.
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Blood Glucose monitor
ReliOn
ReliOn
Used to monitor blood glucose levels in mice.
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Tegaderm
Not specified
3M
Bandage for wound covering in animal experiments.
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Tissue-Tek OCT compound
Not specified
Sakura Finetek
Embedding compound for freezing tissue samples.
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Ki67 antibody
Polyclonal Ki67 Rabbit IgG
Not specified
Antibody for immunolabeling proliferative cells in tissue sections.
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DAPI stain
Not specified
ThermoFisher Scientific
Nuclear counterstain for fluorescence microscopy.
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MATLAB
Not specified
MathWorks
Software for image processing and data analysis.
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