研究目的
回顾冷冻电镜技术的进展，这些进展使得生物大分子能够以近原子分辨率进行可视化，重点介绍了直接电子探测器、超稳定显微镜和图像处理算法的作用。
研究成果
冷冻电镜技术通过直接电子探测器、超稳定显微镜和先进的图像处理技术，实现了生物分子无需结晶的近原子级分辨率结构解析，从而彻底改变了结构生物学领域。该技术目前已适用于包括膜蛋白和动态复合物在内的广泛体系，在药物发现方面具有应用潜力。未来的改进可能涉及更优的探测器、相位板技术以及处理异质性的算法。
研究不足
挑战包括样品异质性、辐射损伤、对均匀样品的需求、样品制备困难（如实现均匀玻璃化层），以及先进显微镜和探测器的高昂成本。相位板存在污染和对中问题，且在研究低于一定尺寸阈值极小分子方面存在局限。
1：实验设计与方法选择：
本文回顾了冷冻电镜技术的历史发展与当前方法学，包括样品制备（如玻璃化）、成像技术（如相位衬度、相位板应用）及图像处理算法（如单颗粒分析、最大似然法）。
2：样本选择与数据来源：
使用蛋白质、大分子复合物和病毒等生物样品，经无染色玻璃化缓冲液制备。
3：实验设备与材料清单：
包含电子显微镜（如FEI Titan Krios、Polara）、直接电子探测器（如DE12、K2、K3）、相位板（如Zernike相位板、Volta相位板）及软件（如RELION、SPIDER、EMAN）。
4：KK3）、相位板（如Zernike相位板、Volta相位板）及软件（如RELION、SPIDER、EMAN）。 实验流程与操作步骤：
4. 实验流程与操作步骤：样品制备采用Vitrobot或CP3等设备进行液乙烷快速冷冻。低温环境下以低剂量电子成像，数据采集通过Leginon或SerialEM软件自动化完成。图像处理包括颗粒筛选、对齐、CTF校正及三维重构。
5：数据分析方法：
运用傅里叶变换、对比传递函数校正、最大似然算法及分类技术实现高分辨率三维重构。
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Titan Krios
Titan Krios
FEI
High-resolution transmission electron microscope used for cryo-EM imaging with ultrastable performance.
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Polara
Polara
FEI
Transmission electron microscope designed for cryo-EM applications.
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Vitrobot
Vitrobot
FEI
Plunge-freezing device for preparing vitrified specimens in cryo-EM.
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DE12
DE12
Direct Electron
Direct electron detector used for high-sensitivity imaging in cryo-EM.
-
K2
K2
Gatan
Direct electron detector with improved performance for cryo-EM.
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K3
K3
Gatan
Advanced direct electron detector with enhanced DQE for cryo-EM.
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CP3
CP3
Gatan
Plunge-freezing device used for specimen preparation in cryo-EM.
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Zernike Phase Plate
ZPP
Phase plate for enhancing contrast in cryo-EM images by introducing a fixed phase shift.
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Volta Phase Plate
VPP
Phase plate that uses a thin carbon film to enhance contrast without the need for exact centering.
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RELION
Software package for single-particle analysis and 3D reconstruction in cryo-EM.
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SPIDER
Software package for image processing in cryo-EM.
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EMAN
Software for electron microscopy image analysis.
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Leginon
Software for automated data collection in electron microscopy.
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SerialEM
Software for automated image acquisition in electron microscopy.
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