研究目的
详细说明使用线粒体特异性光敏剂（特别是MitoTracker Deep Red FM）通过光照触发线粒体自噬的步骤，以实现对线粒体损伤的精确控制并研究线粒体自噬反应。
研究成果
使用线粒体深红FM等光敏剂的光激活方法，为触发线粒体自噬提供了一种精确可控的途径，能在单细胞和群体水平上详细研究线粒体损伤反应。相比化学诱导剂，该方法具有时空特异性和极低脱靶效应的优势，在高内涵筛选和生化检测中具有应用潜力。
研究不足
该方法需要根据细胞类型和条件优化染料浓度及光照设置；过表达EBFP2-Parkin可能导致Parkin易位缺陷；必须控制光照以避免非预期的光漂白和活性氧生成；该方案若不进行适应性调整可能不适用于所有细胞类型。
1：实验设计与方法选择：
该方法利用光激活光敏剂在细胞线粒体内生成活性氧（ROS），引发线粒体功能障碍并触发线粒体自噬。此过程可实现对损伤起始位置、受损线粒体数量及损伤程度的时空精准控制。
2：样本选择与数据来源：
以表达Parkin蛋白的HeLa细胞为模型体系，在含补充剂的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。细胞接种于玻璃底培养皿后转染EBFP2-Parkin载体。
3：实验仪器与材料清单：
包含配备自动载物台的激光扫描共聚焦显微镜、660纳米LED光源、MitoTracker Deep Red FM荧光染料、Lipofectamine 2000转染试剂、细胞培养试剂及固定/染色材料。
4：实验流程与操作步骤：
亚细胞激活实验中，先用MitoTracker Deep Red FM标记细胞，通过特定光照（如635纳米激光）选择性损伤线粒体，并采用延时成像监测；群体性损伤实验则对染色细胞进行平行光全局照射，后续固定染色分析。
5：数据分析方法：
使用显微镜采集图像并进行参数优化的高质量数据量化处理，统计分析方法提及但未详述。
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获取完整内容-
Lipofectamine 2000
11668
Thermo Fisher Scientific
Used for transfection of cells with constructs like EBFP2-Parkin to express mitophagy indicators.
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660 nm LED
M660 L3-C1
Thorlabs
Used as a collimated light source for global impairment of mitochondria in cell populations.
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MitoTracker Deep Red FM
M22426
Life Technologies
Used as a mitochondria-specific photosensitizer dye for staining cells to enable light-induced ROS generation and mitochondrial damage triggering mitophagy.
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Laser-scanning confocal microscope
Used for precise light illumination and imaging to trigger and monitor mitophagy at subcellular levels.
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Microscope stage-top incubator
LCI Chamlide IC
Maintains cells at 37°C and 5% CO2 during live-cell imaging experiments.
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Alexa Fluor 594 wheat germ agglutinin
Used for cell segmentation in high-content screening by staining cell boundaries.
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