研究目的
为了表征和改造光激活腺苷酸环化酶（PACs），以实现对光遗传学中环核苷酸信号传导的精确时空控制。
研究成果
开发的测试平台能高效表征并优化光激活通道蛋白（PACs），从而设计出具有改良光响应特性的变体（例如降低远红光敏感性的DdPAC）。这些工具增强了用于研究环核苷酸信号传导的光遗传学应用。
研究不足
该报告基因检测提供的是PAC活性随时间的间接综合测量值，而非急性活性；其结果受细胞环境及内源性酶（如CpdA）影响；无法直接测定特定酶活性；且仅适用于可在大肠杆菌中表达的PACs。
1：实验设计与方法选择：
设计了一种细菌报告基因检测系统，通过大肠杆菌中cAMP依赖的荧光报告基因（DsRed）表达来监测PAC活性。采用可编程LED照明系统进行可控光照。
2：样本选择与数据来源：
使用大肠杆菌菌株CmpX13 ΔcyaA，携带表达PAC变体（如bPAC、PaaC、DdPAC）的质粒及报告质粒pCyclR。
3：实验设备与材料清单：
微孔板、LED矩阵（含470、525、620 nm或655和850 nm LED）、酶标仪（Tecan Infinite M200 PRO）、HPLC系统（Waters Acquity UPLC）、功率计（Newport 842-PE）及多种生化试剂（如L-阿拉伯糖、IPTG、抗生素）。
4：620 nm或655和850 nm LED）、酶标仪（Tecan Infinite M200 PRO）、HPLC系统（Waters Acquity UPLC）、功率计（Newport 842-PE）及多种生化试剂（如L-阿拉伯糖、IPTG、抗生素）。 实验流程与操作步骤：
4. 实验流程与操作步骤：细菌培养于微孔板中，经L-阿拉伯糖或IPTG诱导后，施加特定光照方案，孵育后测定荧光强度/OD600值。对纯化蛋白采用HPLC检测cAMP产量。
5：数据分析方法：
荧光数据经光密度值标准化后用Fit-o-mat软件分析；HPLC数据通过Waters Empower软件积分；统计学分析包含生物学重复的平均值±标准差。
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LED
WP908A8SRD
Kingbright
Illumination for light activation of photoreceptors
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LED
HE1-120AC-XXXX
Harvatek
Illumination for light activation of photoreceptors
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Power Meter
842-PE
Newport
Calibration of light intensities
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Photodetector
918D-UV-OD3
Newport
Detection of light for calibration
-
Plate Reader
Infinite M200 PRO
Tecan
Measurement of fluorescence and optical density
-
HPLC System
Acquity UPLC
Waters
Quantification of cAMP and ATP
-
Column
Kinetex 5u EVO C18
Waters
Reverse-phase chromatography for cAMP analysis
-
Arduino Board
Uno
Arduino
Control of LED matrix for programmable illumination
-
LED Driver Shield
ITEAD Full Color RGB LED Matrix Driver Shield
Itead
Driving LEDs in the illumination matrix
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