研究目的
开发一种新型荧光生物传感器，用于灵敏检测抗生素雷帕霉素，以解决现有方法中存在的灵敏度低和操作复杂等局限性。
研究成果
所开发的Q'-体传感器，尤其是ATTO520标记的*RK型，为雷帕霉素检测提供了一种简单、快速且灵敏的方法，其检测限（LOD）为0.65 nM，适用于治疗监测。未来改进可提高去淬灭效率并实现体内应用。
研究不足
雷帕霉素诱导的解淬灭效率较低（仅1.5倍增长），且双标记Q'-体比单标记体的响应更弱。由于琥珀抑制不完全，某些染料（如ATTO590）的全长蛋白合成效率较低。潜在的二聚体形成及其影响尚未完全明确。
1：实验设计与方法选择：
本研究采用受Q-body技术启发的淬灭-释放原理，使用通过柔性连接肽连接的FKBP12和FRB结构域。荧光团通过无细胞系统中的琥珀密码子抑制进行位点特异性引入。
2：样本选择与数据来源：
使用FKBP12和FRB的合成基因，荧光团为ATTO520、TAMRA和ATTO590。雷帕霉素购自LKT Laboratories。
3：TAMRA和ATTO590。雷帕霉素购自LKT Laboratories。 实验设备与材料清单：
3. 实验设备与材料清单：设备包括PCR热循环仪、荧光分光光度计（Jasco FP-8500）、His Spin Trap柱（GE Healthcare）、Nanosep离心-3k超滤装置（Pall）以及无细胞翻译系统（Roche Diagnostics的RYTS试剂盒）。材料包括引物、质粒、染料、缓冲液及来自不同供应商的化学品。
4：0）、His Spin Trap柱（GE Healthcare）、Nanosep离心-3k超滤装置（Pall）以及无细胞翻译系统（Roche Diagnostics的RYTS试剂盒）。材料包括引物、质粒、染料、缓冲液及来自不同供应商的化学品。 实验步骤与操作流程：
4. 实验步骤与操作流程：通过SOE PCR构建基因并克隆至质粒。利用含琥珀抑制型tRNA的无细胞翻译系统合成Q'-body，通过固定化金属亲和层析纯化，添加雷帕霉素孵育后进行荧光测量。
5：数据分析方法：
测量荧光光谱，使用Kaleida Graph 4.1中的四参数逻辑方程拟合剂量-反应曲线，并根据Armbruster的定义计算LOD。
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获取完整内容-
fluorescence spectrophotometer
FP-8500
Jasco
Used for measuring fluorescence spectra of Q'-bodies after rapamycin addition.
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quartz cell
5 mm × 5 mm
Jasco
Used as a container for fluorescence measurements.
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His Spin Trap Column
GE Healthcare
Used for purifying synthesized Q'-bodies via immobilized metal affinity chromatography.
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Nanosep Centrifugal-3k ultrafiltration device
Pall
Used for buffer exchange during purification of Q'-bodies.
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cell-free transcription-translation system
RYTS kit
Roche Diagnostics
Used for synthesizing Q'-bodies with site-specific fluorophore incorporation.
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DNA polymerase
KOD-plus-neo
Toyobo
Used for PCR amplification of genes.
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plasmid miniprep system
PureYield
Promega
Used for preparing plasmid DNA.
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software
Kaleida Graph 4.1
Synergy Software
Used for fitting dose-response curves and calculating EC50 values.
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