研究目的
生成新型红色荧光基因编码钙指示剂（RGECIs）的快速变体，并研究其动力学机制以改进细胞内快速钙动态的监测。
研究成果
该研究成功生成了具有改进动力学特性的jRGECO1a和jRCaMP1a快速衰减变体。通过阐明其动力学机制，揭示了jRGECO1a与jRCaMP1a类型间的差异。由于这些新型传感器具有线性响应特性且能保留未过滤的动力学细节，它们在肌肉收缩和高频放电神经元等快速、高振幅信号的活体成像中表现更优。
研究不足
该研究指出，jRGECO1a及其变体表现出强烈的光开关效应，这可能导致伪影。此外，原位衰减速率比溶液中的测量值更慢，表明在某些情况下探针动力学可能并非限制因素。突变在某些情况下会轻微降低亲和力和动态范围。
1：实验设计与方法选择：
通过引入特定突变以减弱钙调蛋白（CaM）与RS20肽之间的相互作用，生成了jRGECO1a和jRCaMP1a的快速变体。利用停流荧光法和成像技术分析动力学机制。
2：样本选择与数据来源：
蛋白质在大肠杆菌BL21(DE3)gold细胞中表达并纯化。使用HEK293T细胞和海马CA3神经元进行细胞成像。
3：实验设备与材料清单：
设备包括Hi-Tech Scientific KinetAsyst停流装置、Fluorolog3荧光光谱仪、Lambda Bio40分光光度计、3i Marianas转盘共聚焦显微镜、配备MaiTai DeepSee激光器的双光子显微镜系统，以及各种缓冲液和化学试剂。
4：实验流程与操作步骤：
进行定点诱变，表达并纯化蛋白质，开展pH滴定、量子产率测量、平衡钙离子滴定、停流动力学分析，以及在细胞和海马切片中的成像。
5：数据分析方法：
采用单指数或双指数函数拟合数据，平衡滴定使用Hill方程，建立动力学模型并与数据拟合。
独家科研数据包，助您复现前沿成果，加速创新突破
获取完整内容-
Hi-Tech Scientific KinetAsyst
double-mixing stopped-flow apparatus
Hi-Tech Scientific
Used for stopped-flow fluorimetry to measure calcium association and dissociation kinetics.
-
Fluorolog3
Horiba
Used for recording fluorescence emission spectra and pH titrations.
-
Lambda Bio40
Perkin Elmer
Used for measuring absorption spectra.
-
3i Marianas spinning-disk confocal microscope
3i
Used for imaging in HEK293T cells.
-
MaiTai DeepSee
Spectra Physics
Pulsed Ti:Sapphire laser used for two-photon excitation in microscopy.
-
HisTrap column
GE healthcare
Used for protein purification.
-
?kta Explorer system
GE healthcare
Used for protein purification.
-
Axoporator 800A
Molecular Devices
Used for single-cell electroporation.
-
Multiclamp 700B amplifier
Molecular Devices
Used for whole-cell recordings in electrophysiology.
-
登录查看剩余7件设备及参数对照表
查看全部
