研究目的
介绍一种信号调制方法，该方法可开发单标记信号开启或信号关闭的肽传感器，用于监测酶促翻译后修饰，且无需改变检测条件即可选择信号方向。
研究成果
所引入的信号调制方法成功实现了单标记策略下PTM检测的可调式信号开启与关闭模式。该方法仅需改变可溶性调节剂即可选择信号方向，无需调整其他检测条件。该技术具有高通量兼容性，提供纳摩尔级灵敏度，并有望在PTM检测之外获得更广泛应用。
研究不足
与615 nm处TRF信号读数相比，TR-FRET检测的信噪比更低，因为实验条件是针对后者优化的。该研究未完全优化TR-FRET检测的调节剂浓度，且PTP1B的底物肽也未优化，可能影响检测性能。该方法在磷酸化修饰检测之外的其他检测中的适用性尚未得到充分验证。
1：实验设计与方法选择：
本研究通过引入不同的可溶性Eu3+信号调节分子，改进了QRET检测原理，实现了信号开启和信号关闭的传感模式。该方法命名为调制时间分辨荧光共振能量转移（mTR-FRET），并利用肽断裂平台展示了其对酶促磷酸化/去磷酸化的监测能力。设计原理是通过选择不同调节分子实现可调信号读出，而无需改变其他检测参数。
2：样本选择与数据来源：
使用蛋白激酶A（PKA）和蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）的底物肽，具体为从Pepmic公司购买的LZ-S和LZ-pY肽段。酶（PKA和PTP1B）及抑制剂（星形孢菌素、H-89、Na3VO4）均采购自商业供应商。
3：Na3VO4）均采购自商业供应商。 实验设备与材料清单：
3. 实验设备与材料清单：设备包括Varian Cary Eclipse荧光分光光度计、Cary 60紫外-可见分光光度计、Labrox酶标仪和Victor 1420多标记计数器。材料包含EuLZ检测肽、可溶性调节分子（Dy1、Dy2、Dy3、Dy4）、酶、抑制剂、ATP、检测缓冲液组分以及Corning 384孔黑色低容量检测板。
4：DyDyDy4）、酶、抑制剂、ATP、检测缓冲液组分以及Corning 384孔黑色低容量检测板。 实验流程与操作步骤：
4. 实验流程与操作步骤：酶促反应在384孔板中进行，最终体积为20 μL。反应包括将酶与底物肽和抑制剂孵育，加入检测组分（EuLZ和调节分子），并通过时间分辨荧光在615 nm（TRF）或665 nm（TR-FRET）波长下监测信号，设置特定延迟时间和窗口时间。实验在室温下进行，最长持续90分钟。
5：数据分析方法：
使用Origin 8软件分析数据，计算信噪比（S/B）和变异系数（CV%）。采用S型曲线拟合函数测定IC50值。
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fluorescence spectrophotometer
Varian Cary Eclipse
Agilent Technologies
Recorded emission and excitation spectra for EuLZ and modulators
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Cary 60
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Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer
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Labrox
Labrox Ltd
Monitored TRF and TR-FRET signals in assays
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multilabel counter
Victor 1420
PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac
Monitored TRF and TR-FRET signals in assays
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software
Origin 8
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