研究目的
监测线粒体或溶酶体中的NO以研究NO相关的化学生物学。
研究成果
所开发的基于BODIPY的探针(BDP-NO、Mito-NO、Lyso-NO)对一氧化氮表现出优异的选择性、灵敏度和快速响应特性,且细胞毒性低。Mito-NO和Lyso-NO分别成功靶向线粒体和溶酶体,可在活细胞中实现对这些细胞器内一氧化氮的特异性检测。这些探针是研究亚细胞水平上一氧化氮相关生理及病理过程的有效工具。
研究不足
探针Mito-NO-T由于极性三唑键的潜在干扰,显示出较差的线粒体靶向能力。该研究聚焦于HeLa细胞和RAW264.7巨噬细胞,未探索其在其他细胞类型或体内系统中的适用性。尽管响应时间和灵敏度良好,但在复杂生物环境中可能仍有优化空间。
1:实验设计与方法选择:
采用N-亚硝化策略理性设计四种基于BODIPY的荧光探针(BDP-NO、Mito-NO-T、Mito-NO、Lyso-NO)用于一氧化氮检测。合成过程包括亲核取代、点击化学、还原胺化和烷基化反应。在PBS-CH3CN溶液中通过紫外-可见光谱和荧光光谱进行光谱评估。使用共聚焦显微镜进行细胞成像。
2:样本选择与数据来源:
培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中的人宫颈癌细胞(HeLa)和RAW264.7巨噬细胞?;Х治鑫铮℉2O2、ClO-、1O2、O2?-、OH·、ONOO-、MGO、AA、DHA、Cys、Hcy、GSH、NO2-、Br-、I-、HCO3-、Cl-、DEA·NONOate)制备于PBS缓冲液中。
3:7巨噬细胞?;Х治鑫铮℉2OClO-、1OO2?-、OH·、ONOO-、MGO、AA、DHA、Cys、Hcy、GSH、NO2-、Br-、I-、HCO3-、Cl-、DEA·NONOate)制备于PBS缓冲液中。 实验设备与材料清单:
3. 实验设备与材料清单:Varian Model Mercury 400 MHz或600 MHz核磁共振仪(1H-NMR)、Varian Model Mercury 150 MHz核磁共振仪(13C-NMR)、Agilent 6120四极杆液质联用仪、AB SCIEX TRIPLE TOF 5600+质谱仪(ESI-HRMS)、759S紫外-可见分光光度计(棱光科技)、F98荧光分光光度计(棱光科技)、Millipore elix/RIOs纯水系统、共聚焦激光扫描显微镜(卡尔蔡司LSM 710)、CytoFLEX S流式细胞仪(贝克曼)、线粒体深红FM追踪染料、溶酶体红色追踪染料、Annexin V-FITC和PI(碧云天)。
4:0)、CytoFLEX S流式细胞仪(贝克曼)、线粒体深红FM追踪染料、溶酶体红色追踪染料、Annexin V-FITC和PI(碧云天)。 实验流程与操作步骤:
4. 实验流程与操作步骤:探针合成与纯化。光谱测量:将探针(10 μM)与分析物置于PBS-CH3CN溶液(pH 7.4)中,检测515 nm处荧光信号(激发波长495 nm)。细胞活性检测(MTT法)、凋亡检测(Annexin V/PI染色)、细胞成像:与探针(10 μM)和DEA·NONOate(200 μM)共孵育,并使用细胞器追踪染料共染色。
5:4)中,检测515 nm处荧光信号(激发波长495 nm)。细胞活性检测(MTT法)、凋亡检测(Annexin V/PI染色)、细胞成像:
5. 数据分析方法:荧光强度分析、检测限计算(3σ/k)、共定位重叠系数、重复实验的统计学分析。
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