研究目的
为了开发一种三分子荧光互补（TriFC）系统，用于在植物体内可视化RNA-蛋白质相互作用，因为在此之前尚未有方法能在活体植物中成像RNA-蛋白质相互作用。
研究成果
TriFC检测法成功实现了植物体内RNA-蛋白质相互作用的可视化，为研究长链非编码RNA功能提供了新工具。该方法结合双分子荧光互补（BiFC）和MS2系统，通过YFP互补来检测相互作用，并以ELENA1和MED19a进行了验证。该技术能揭示RNA-蛋白质复合体的亚细胞定位与动态变化，在植物生物学领域具有更广泛的应用潜力。
研究不足
转录后基因沉默（PTGS）可能降低效率，可通过与pUBQ:p19共浸润来缓解。若未检测到信号，可能需要测试6xMS2标签和YFP片段方向的最佳组合。该方法为瞬时表达，可能无法反映稳定相互作用。
1：实验设计与方法选择：
TriFC系统将双分子荧光互补（BiFC）系统与MS2系统结合用于RNA成像。目标RNA标记6xMS2重复序列，MCP和RNA结合蛋白与YFP片段融合。当RNA-蛋白相互作用时，YFP片段互补发出荧光，通过共聚焦显微镜观察。
2：样本选择与数据来源：
使用2-4周龄（6-10叶期）本氏烟草植株。特定构建体包括pENTR-ELENA1（长链非编码RNA）、pENTR-Med19a（RNA结合蛋白）和pENTR-MCP。
3：实验设备与材料清单：
包含目标载体（pBA3130、pBA3132、pBA3134、pBA3136、pBA-6xMS2-DC、pBA-DC-6xMS2）、入门克隆、LR Clonase II、大肠杆菌DH5α、农杆菌GV3101、抗生素（壮观霉素、卡那霉素）、LB培养基、乙酰丁香酮、共聚焦激光扫描显微镜（ZEISS LSM 780）及ZEN图像分析仪。
4：pBApBApBApBA-6xMS2-DC、pBA-DC-6xMS2）、入门克隆、LR Clonase II、大肠杆菌DH5α、农杆菌GV抗生素（壮观霉素、卡那霉素）、LB培养基、乙酰丁香酮、共聚焦激光扫描显微镜（ZEISS LSM 780）及ZEN图像分析仪。 实验流程与操作步骤：
4. 实验流程与操作步骤：通过LR反应构建载体并转化至大肠杆菌和农杆菌。制备农杆菌培养液，混合后用注射器渗透烟草叶片。植株孵育2-3天后，在514nm激发光和520-550nm发射光下用共聚焦显微镜观察YFP信号。
5：数据分析方法：
使用ZEN图像分析仪分析YFP荧光信号以确认RNA-蛋白相互作用。
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Microscope for observing YFP fluorescence signals to visualize RNA-protein interactions in vivo
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