利用SYN1和CaMKII启动子表达的通道视紫红质-2对二维和三维培养体系中iPS细胞来源神经元的光遗传学控制

摘要： 在三维（3D）环境中开发光遗传学可控的人类神经网络模型，可提供一个与生理相关或模拟人脑的研究系统。通过慢病毒和细胞类型特异性启动子，将通道视紫红质-2（ChR2）转导至人诱导多能干细胞（hiPSCs）来源的神经祖细胞（Axol），从而生成光敏神经元。经神经分化后，获得由人iPSCs来源的皮层神经元、星形胶质细胞和祖细胞组成的混合群体（Axol-ChR2）。利用泛神经元启动子突触蛋白-1（SYN1）和兴奋性神经元特异性启动子钙调蛋白激酶II（CaMKII）驱动报告基因表达，以评估靶细胞的分化状态。采用流式细胞术和免疫荧光染色评估分化后Axol-ChR2细胞中ChR2的表达及各亚群特征。将这些细胞从二维培养转移至经精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）和小分子（Y-27632）功能化的三维海藻酸盐水凝胶中。对改良的RGD-海藻酸盐水凝胶进行物理特性表征及细胞活性评估，以建立适用于hPSCs和神经细胞的通用3D培养体系。在细胞包封前，采用钙成像技术研究Axol-ChR2细胞和原代神经元的神经网络活动。结果表明，通过CaMKII和SYN1启动子表达ChR2均成功实现了功能性活动。该RGD-海藻酸盐水凝胶体系支持分化后Axol-ChR2细胞的生长，同时在光刺激下可检测到ChR2表达，从而实现对三维人类神经网络的精准无创调控。