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2016年欧洲显微镜学大会论文集 || 利用纳米颗粒标记和液相电子显微镜研究完整细胞中的膜蛋白
摘要： 细胞质膜上存在受体蛋白，它们如同"倾听者"接收外界的化学信号。这些信号由配体（能与受体特异性结合的小分子）构成。但由于现有分析方法的局限性，这些信号如何被解读并引发细胞决策的过程尚未完全阐明。通常极难直接观察内源性表达的单个蛋白质如何在完整细胞中响应配体结合——这种结合可能触发形成蛋白质复合物进而启动信号传导过程。目前通过生化方法获得的细胞功能知识，大多基于成千上万个细胞的混合材料分析，因而反映的是群体平均水平。但要理解细胞解读信号的基本机制，必须着眼于单个细胞。如今利用液相扫描透射电子显微镜（STEM）[1,2]，已能在完整真核细胞的纳米尺度研究膜蛋白。关键步骤是将目标蛋白与小探针（如金纳米颗粒或量子点等纳米颗粒）以一对一比例特异性标记。将液态细胞置于微流控腔室中（该腔室使样本处于电镜真空环境），即可进行STEM成像。某些研究无需完全封闭细胞，仅需获取细胞表层薄区的信息，此时采用配备STEM探测器[3]的环境扫描电子显微镜（ESEM）即可实现高分辨率成像。液相STEM曾被用于研究完整SKBR3乳腺癌细胞中表皮生长因子HER2在单分子水平的形成过程[4]。作为膜蛋白的HER2对乳腺癌侵袭性和进展具有重要作用，基于单个HER2位置计算配对相关函数的数据分析显示：不同细胞区域间、乃至不同细胞间存在显著的功能差异，这些发现可能为癌症转移和药物反应研究提供重要线索。
关键词： 量子点、扫描透射电子显微镜（STEM）、环境扫描电子显微镜（ESEM）、完整细胞、液相、表皮生长因子受体（EGFR）、人表皮生长因子受体2（HER2）
更新于2025-09-23 15:21:21
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64Cu标记的GE11修饰聚合物胶束纳米颗粒在结直肠癌模型中用于EGFR靶向分子成像的合成与分析
摘要： 聚合物胶束纳米颗粒是用于靶向药物递送的多功能且生物相容性良好的平台。然而，追踪其在体内的生物分布、稳定性和清除过程具有挑战性。本研究旨在制备表面修饰有表皮生长因子受体（EGFR）靶向肽GE11的胶束。体外荧光研究表明，与EGFR阴性的SW620细胞相比，GE11胶束能更显著地被表达EGFR的HCT116结肠癌细胞内化。通过肽骨架中酪氨酸残基与芳基重氮盐的偶氮偶联反应，用放射性核素64Cu标记胶束以实现正电子发射断层扫描（PET）成像。对64Cu标记胶束的体内分析显示其具有较长的血液循环时间和主要的肝胆清除途径。在荷HCT116肿瘤小鼠中，比较了EGFR靶向的GE11胶束与非靶向HW12胶束的生物分布特征。PET结果显示两种胶束的肿瘤-肌肉比值在48小时内持续升高。含GE11的胶束在HCT116肿瘤中的蓄积量高于HW12修饰的胶束。我们的数据表明，如癌症生物标志物EGFR所示，通过主动靶向可增强胶束纳米颗粒图像引导治疗的疗效。
关键词： 聚合物胶束，表皮生长因子受体（EGFR），64Cu，GE11肽，结直肠癌，正电子发射断层扫描（PET）
更新于2025-09-23 15:21:01
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PACAP通过EGFR转激活维持人角膜内皮完整性
摘要： 角膜内皮由单层六边形细胞组成，这些细胞紧密附着于Descemet膜上。其主要功能是通过调节组织水合作用来维持透明度。创伤、衰老或其他病理状况会导致细胞流失，而存活细胞的代偿性增大则通过调节房水与基质间的液体交换来平衡这种损失。当无法保证有效修复时，采用供体周边角膜-巩膜组织分离的人角膜内皮细胞（HCECs）的再生医学可能成为突破移植难题的理想方案。先前研究已证实，在生长因子剥夺条件下，垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）处理可阻止HCECs退化。但该效应的分子机制尚未阐明。本研究首次揭示了人角膜内皮中PACAP及其受体（PAC1R）的表达，并证明该肽段通过选择性结合PAC1R，诱导表皮生长因子受体（EGFR）磷酸化及MAPK/ERK1/2信号通路激活。结论表明：PACAP可能通过EGFR转激活作用成为维持人角膜内皮完整性的重要营养因子。因此，PACAP可与表皮生长因子、成纤维细胞生长因子协同作用，通过支持角膜内皮屏障完整性来保障组织生理功能。
关键词： 表皮生长因子受体、人角膜内皮细胞、丝裂原活化蛋白激酶、垂体腺苷酸环化酶激活多肽
更新于2025-09-23 15:19:57
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单分子F?rster共振能量转移测量揭示表皮生长因子受体C端结构域的动态部分有序结构
摘要： 内在无序蛋白（IDPs）或区域（IDRs）被认为能在不形成有序结构的情况下展现独特功能。然而这些分子机制不易阐明，部分原因在于结构信息测量难度较大。本研究采用交替激光激发（ALEX）法与圆二色谱（CD）技术，探究人表皮生长因子受体（EGFR）C端尾部（CTT）结构域的结构特征。通过添加氯化钾（KCl）、尿素或盐酸胍（GdmCl）改变溶液条件后，利用ALEX获取的F?rster共振能量转移（FRET）单分子分布数据，使我们能分别考察电荷相互作用与二级结构形成的影响。CD光谱分析揭示了所包含二级结构的类型。结果表明：CTT结构主要受以反平行β-折叠为主的二级结构形成（而非电荷相互作用）影响，且Grb2主要结合位点的磷酸化会部分破坏该二级结构。我们的发现提示，EGFR CTT可能通过局部β-折叠形成或伴随磷酸化状态的解构来调控配体结合动力学。
关键词： 圆二色性、表皮生长因子受体、福斯特共振能量转移、二级结构、内在无序蛋白
更新于2025-09-23 15:19:57
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基于荧光厄洛替尼示踪剂的EGFR突变实时分子光学显微成像
摘要： 背景：通过肿瘤DNA测序常规检测肺腺癌中的EGFR突变。本研究旨在评估一种荧光标记的厄洛替尼治疗诊断试剂，利用小鼠异种移植模型和光纤共聚焦荧光显微镜（FCFM），在体外和离体条件下对突变型EGFR肿瘤进行分子成像。方法：本实验室通过将荧光素添加到厄洛替尼分子上合成了该荧光示踪剂。将三种EGFR突变型人腺癌细胞系（HCC827、H1975和H1650）和一种EGFR野生型细胞系（A549）异种移植到35只裸鼠体内。暴露于示踪剂后进行MTT细胞活力测定。体外成像使用1μM示踪剂溶液，离体成像则对从小鼠身上新鲜切取的肿瘤进行1μM示踪剂PBS溶液1小时孵育。采用FCFM进行实时分子成像，并记录每次实验的中位荧光强度（MFI）。结果：MTT细胞活力测定证实，在厄洛替尼中添加荧光素不会抑制其对肿瘤细胞的细胞毒性。体外FCFM成像显示，该示踪剂能区分EGFR突变型与野生型细胞系（p<0.001）。EGFR突变型异种移植瘤的离体FCFM成像MFI显著高于野生型（p<0.001）。以354任意单位为临界值时，该示踪剂的MFI对识别EGFR突变型肿瘤的灵敏度为100%，特异度为96.3%。结论：使用荧光标记厄洛替尼的实时分子成像技术能够识别离体EGFR突变型肿瘤。
关键词： 肺癌，厄洛替尼，治疗诊断学，表皮生长因子受体，表皮生长因子，纤维共聚焦荧光显微镜，分子成像
更新于2025-09-23 13:45:19
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非磁性量子点与磁性量子点 || 生物分子偶联量子点纳米传感器作为活细胞内动态事件的探测探针
摘要： 一种结合了与适当肽段或抗体偶联的半导体量子点（QD）纳米传感器的单分子追踪/成像技术，对于探测活细胞中的细胞动态事件极具吸引力。我们开发了一种基于归一化方差与均方位移（MSD）的二维单分子轨迹分析方法，在保持单分子灵敏度的同时，利用纳米传感器提供高质量的统计数据。相较于单独使用MSD，该图谱能更全面地反映蛋白质在细胞环境中的扩散动力学特征。我们通过精选案例展示了该技术的性能，这些案例旨在揭示其在活细胞中的功能重要性。研究发现表明，生物分子偶联的QD纳米传感器可用于揭示蛋白质的相互作用、化学计量比及构象信息，并有助于理解活细胞中生物分子的相互作用模式、稳定状态及动态作用路径。
关键词： 表皮生长因子受体、单粒子追踪、肌动蛋白丝、量子点、荧光成像、随机热力学、单分子轨迹、活细胞、质膜、脂质域、细胞穿透肽
更新于2025-09-19 17:13:59
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荧光素和表皮生长因子受体抗体偶联的二氧化硅纳米颗粒用于增强头颈部鳞状细胞癌共聚焦激光内镜实时肿瘤边界界定
摘要： 头颈部癌症手术中确定无肿瘤切缘具有挑战性。在本项原理验证研究中，我们评估了一种新型二氧化硅纳米颗粒制剂作为造影增强剂的潜在应用价值。我们合成了平均粒径45纳米的二氧化硅纳米颗粒，并通过荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)进行颗粒示踪标记，同时结合表皮生长因子受体(EGFR)靶向抗体以增强肿瘤特异性。这些纳米颗粒表现出良好的生物相容性，可通过共聚焦激光扫描显微镜在体内外进行检测。此外，离体实验表明这些修饰后的纳米颗粒能特异性结合肿瘤样本，并能通过手持式共聚焦荧光内镜进行检测。从临床角度看，我们认为该方法可用于肿瘤边界造影增强，从而更好地实现术中R0级肿瘤切除范围的判定。
关键词： 二氧化硅纳米颗粒、表皮生长因子受体、造影剂
更新于2025-09-19 17:13:59
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细菌光敏色素作为支架，用于构建受近红外光调控的受体酪氨酸激酶工程
摘要： 光控受体酪氨酸激酶（opto-RTKs）可通过光信号调控RTK信号通路。此前多数opto-RTKs依赖蓝绿光激活。我们将耐辐射奇球菌细菌光敏色素（DrBphP-PCM）的光传感核心?？橛肷窬蜃邮芴宓募っ附峁褂蛉诤希晒菇讼煊?50纳米以上红光的opto-RTKs。为将该工程技术拓展至其他RTK家族，本研究将DrBpP-PCM分别与表皮生长因子受体（EGFR）和成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）的胞质结构域结合，由此获得的Dr-EGFR和Dr-FGFR1 opto-RTKs能被近红外光快速激活、远红光有效失活，并高效触发ERK1/2、PI3K/Akt及PLC-γ信号通路。该opto-RTKs与基于GFP的生物传感器无光谱串扰，可实现Dr-FGFR1激活与钙瞬变的同步检测。通过现有RTK结构分析，我们阐释了DrBphP-PCM基opto-RTKs的作用机制。这种多功能支架蛋白可构建出通过远红光和近红外光可逆调控的新型opto-RTKs。
关键词： 成纤维细胞生长因子受体、细菌光敏色素1、表皮生长因子受体、DrBphP、细菌光敏色素、Dr受体酪氨酸激酶
更新于2025-09-19 17:13:59
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通过治疗诊断性Ag?S量子点靶向递送5-FU，绕过EGFR阳性肺癌细胞中自噬的促存活和耐药机制
摘要： 将成像与治疗功能集于一体的靶向给药系统在纳米医学领域备受青睐。近红外发射的硫化银量子点（Ag2S QDs）是实现该功能的理想载体。本研究开发了聚乙二醇化硫化银量子点，通过偶联西妥昔单抗（Cet）抗体并负载抗癌药物5-氟尿嘧啶（5FU），构建了诊疗一体化量子点。利用低表达（H1299）和高表达（A549）表皮生长因子受体（EGFR）的肺癌细胞系，证实该诊疗量子点可实现靶向近红外成像与治疗。实验表明：Cet偶联量子点能选择性地将5FU高效递送至A549细胞，显著增强诱导细胞凋亡的杀伤效果。值得注意的是，虽然游离5FU治疗会激活具有抗凋亡作用的细胞自噬机制，但相比单纯5FU治疗，这种EGFR靶向多功能量子点能显著克服药物耐药性。研究认为其治疗优势源于：纳米颗粒（及负载药物）通过增强受体介导的内吞作用实现高效摄取，同时在不额外添加自噬抑制剂的情况下有效抑制自噬过程，二者协同提升了A549细胞的治疗效果。
关键词： 肺癌、表皮生长因子受体、诊疗一体化、硫化银量子点、自噬、靶向药物递送、5-氟尿嘧啶
更新于2025-09-16 10:30:52
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等离子体量子探针的癌症信号传导
摘要： 尽管金量子点在非细胞传感领域的应用正快速增长，但由于其整体尺寸较大（生物相容性包覆层）、细胞内低浓度代谢物的拉曼信号重叠以及量子点在癌细胞内的分散性问题，量子金点的实际应用仍受限。这源于量子点标记会导致细胞内特异性结合及分布不均。此外，湿法合成残留的化学物质使量子点具有天然毒性，阻碍了其临床应用转化。为提高生物相容性和细胞摄取率，金探针通常需包覆生物薄膜（如PEG）。但这种包覆会阻碍代谢物与金量子点的相互作用，抑制表面等离子体共振效应，导致拉曼信号减弱。生物薄膜的添加还会增大金量子点的流体力学尺寸，限制等离子体量子点在细胞及细胞核内的分散与内化，从而丧失等离子体探针量子尺寸特有的性质。 要保留量子点的量子尺寸特性，必须采用物理合成方法并避免包覆层。本研究论文首次推出量子尺寸无包覆层等离子体量子探针（PQPs），这种癌症传感新工具能同步检测表面癌蛋白、胞内癌蛋白及细胞核代谢物。我们创新性地提出用于细胞内传感的等离子体量子探针概念——据我们所知，这是首次合成出接近细胞代谢物尺寸的探针。通过物理合成法（多光子激光电离）制备的生物相容性PQPs无需化学掺杂，彻底消除了生物包覆层需求。由于PQPs本身无毒性，无需包覆层即可研究等离子体细胞信号传导中的真实量子效应。裸露的PQPs能实现自发性细胞摄取，在所有细胞组分上均匀分散且非特异性附着。由此产生的拉曼光谱能在单一谱图中同步呈现表面（如EGFR）、胞内（如HPV E6/E7）及核代谢物（如DNA/RNA）等多细胞组分的丰富信息。由于细胞内探针数量差异，癌细胞信号强度显著高于成纤维细胞，表明通过分析拉曼读数强度可实现癌细胞鉴别。研究发现探针尺寸与等离子体读数信号强度呈反比关系。PQP技术能全面呈现细胞状态，为癌症精准诊断开辟新途径。
关键词： 等离子体激元信号传导、表皮生长因子受体、传感、人乳头瘤病毒E6/E7蛋白、量子探针
更新于2025-09-16 10:30:52