研究目的
展示利用联合三次谐波生成与三光子荧光显微镜技术，对H&E染色的整体组织进行无切片组织病理学成像，以实现癌症手术中快速术中切缘评估。
研究成果
该研究成功实现了对苏木精-伊红（H&E）染色整体组织样本的无切片非线性显微成像，分辨率达到亚飞升级别，其对比度和特征表现与传统H&E组织学相当。该方法相比冷冻病理学缩短了制备时间，能保留真实切缘，且与标准H&E染色兼容，有望应用于莫氏显微描记手术等术中快速切缘评估。未来工作应聚焦于方案优化和临床验证。
研究不足
该显微镜系统的轴向分辨率为3.4微米，由于色差影响，该数值劣于理论值，可能对图像质量造成不利影响。该方法需要对整体组织切片的染色方案和色彩重映射参数进行进一步优化。需通过临床试验验证其术中应用的有效性，且叠加成像可能会延长成像时间，故不建议用于实时应用场景。
1：实验设计与方法选择：
本研究采用基于1260纳米飞秒Cr:镁橄榄石激光器的非线性显微系统，进行三次谐波生成（THG）和三光子荧光（3PF）成像。设计原理是通过利用H&E染料非线性光学特性实现无物理切片虚拟切片。
2：样本选择与数据来源：
人皮肤组织样本（包括正常组织、基底细胞癌(BCC)、鳞状细胞癌(SCC)及乳房外Paget病(EMPD)标本）取自冷藏生理盐水保存的手术样本。组织制备为薄切片或整体层（约1毫米厚）以模拟莫氏显微外科手术条件。
3：实验设备与材料清单：
关键设备包括Cr:镁橄榄石激光器、倒置显微镜（Olympus IX71）、物镜（如UAPON 40XW340）、光谱仪（Andor Shamrock 303i）、光电倍增管（Hamamatsu R4220P、R928P）及各类光学元件（透镜、滤光片、分束器）。材料包含H&E染料（Sigma-Aldrich血晶素、J.T.Baker伊红）、甲醛、氨水及盖玻片。
4：1）、物镜（如UAPON 40XW340）、光谱仪（Andor Shamrock 303i）、光电倍增管（Hamamatsu R4220P、R928P）及各类光学元件（透镜、滤光片、分束器）。材料包含H&E染料（Sigma-Aldrich血晶素、J.T.Baker伊红）、甲醛、氨水及盖玻片。 实验流程与操作步骤：
4. 实验流程与操作步骤：采用简化H&E染色方案（甲醛、血晶素、氨水、伊红及清洗步骤）处理组织。通过非线性光谱学表征染料发射特性。成像时聚焦激光束至样本，收集物镜共聚焦获取的THG和3PF信号，经二向色分束器与滤光片分离后由光电倍增管检测。图像以512×512像素、14.5帧/秒采集并累积优化质量。Z轴堆叠用于深度成像。
5：5帧/秒采集并累积优化质量。Z轴堆叠用于深度成像。 数据分析方法：
5. 数据分析方法：光谱数据采用高斯拟合与功率依赖性研究（三次方拟合）。图像在ImageJ中基于比尔-朗伯定律（含H&E衰减常数）进行色彩重映射。空间分辨率通过点光源半高全宽(FWHM)测定。
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Objective
C330TME-C
Thorlabs
Focuses the laser beam on the sample in the spectroscopy system.
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Neutral density filter
NDC-50C-4M-B
Thorlabs
Regulates the average laser power to avoid thermal damage.
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Spectrometer
Shamrock 303i
Andor
Measures emission spectra from samples.
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EMCCD detector
Newton 970
Andor
Detects spectral signals, cooled to reduce dark currents.
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Inverted microscope
IX71
Olympus
Base for the nonlinear optical microscope setup.
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Scanning head
MPM-2PKIT
Thorlabs
Provides 2-D scanning for the laser beam.
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Water-immersion objective
UAPON 40XW340
Olympus
Focuses the scanning beam onto specimens for imaging.
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Motorized 2D-scanning stage
MLS203
Thorlabs
Adjusts lateral imaging position of specimens.
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Dichroic beamsplitter
FF705-Di01
Semrock
Reflects collected nonlinear signals to PMTs.
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Photomultiplier tube
R4220P
Hamamatsu
Detects THG signals.
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Photomultiplier tube
R928P
Hamamatsu
Detects 3PF signals.
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Amplifier
C6438-01
Hamamatsu
Improves detecting efficiencies of PMTs.
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Bandpass filter
FF01-417/60-25
Semrock
Filters THG signals.
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Hematoxylin
MHS16
Sigma-Aldrich
Staining dye for nuclei, provides THG contrast.
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Cr:forsterite laser
Laser source for excitation at 1260 nm with femtosecond pulses.
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Motorized stage
MFA-CC
Newport
Controls sample position in the spectroscopy system.
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Stage
TSDM40-15X
SIGMA KOKI
Used for z scanning in the microscope.
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Bandpass filter
HQ565/55x
Chroma
Filters 3PF signals.
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Eosin
3800
J.T.Baker
Staining dye for cytoplasm, provides 3PF contrast.
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