研究目的
研究所有已知致病性α-突触核蛋白突变体对体外脂质结合和聚集行为的影响，旨在理解帕金森病等突触核蛋白病的差异机制。
研究成果
该研究表明，不同α-突触核蛋白突变体表现出各异的脂质结合与聚集特性：A30P突变体脂质结合能力降低且易形成寡聚体但纤维形成缓慢，而A53T、H50Q和G51D突变体则加速纤维形成。金属离子会抑制纤维形成，混合实验显示聚集速度更快的变体主导动力学过程。这些发现揭示了突触核蛋白病中存在多条聚集途径，有助于理解帕金森病的发病机制并为治疗策略提供依据。
研究不足
该研究为体外实验，可能无法完全复现体内条件。检测条件（如蛋白质浓度、金属离子的使用）可能影响结果，聚集动力学的差异或源于特定实验设置。研究聚焦于已知突变体，其发现可能不适用于所有突触核蛋白病。
1：实验设计与方法选择：
本研究采用单分子荧光光谱技术（SIFT和FIDA）及基于ThT荧光的测量方法，在受控条件下分析α突触核蛋白突变体的脂质结合、寡聚体形成及纤维化过程。理论模型包含用于定量结合与聚集的荧光强度分布分析。
2：样本选择与数据来源：
重组野生型及突变型α突触核蛋白（A30P、E46K、H50Q、G51D、A53E、A53T）由大肠杆菌表达并纯化。使用二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）制成的小单层囊泡（SUVs）进行结合研究。
3：0P、E46K、H50Q、G51D、A53E、A53T）由大肠杆菌表达并纯化。使用二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）制成的小单层囊泡（SUVs）进行结合研究。 实验设备与材料清单：
3. 实验设备与材料清单：设备包括用于SIFT测量的Insight读数仪、ThT荧光检测的FLUOStar OPTIMA酶标仪、电子显微镜（Libra 120）、分光光度计（Jasco 550和810）及超声波仪。材料包含荧光染料（Alexa Fluor-647、Bodipy-PE）、脂质（DPPC）、金属离子（FeCl3、AlCl3）及缓冲液。
4：0）、分光光度计（Jasco 550和810）及超声波仪。材料包含荧光染料（Alexa Fluor-Bodipy-PE）、脂质（DPPC）、金属离子（FeClAlCl3）及缓冲液。 实验流程与操作步骤：
4. 实验流程与操作步骤：脂质结合实验中，标记α突触核蛋白（10-20 nM）与DPPC-SUVs（10 μM）孵育后测定；寡聚体形成实验中，α突触核蛋白与Fe3+或Al3+（10 μM）孵育分析；纤维化实验中，α突触核蛋白（50 μM）震荡孵育并通过ThT荧光监测动力学，电镜确认纤维形成。
5：数据分析方法：
采用二维FIDA直方图及拟合软件（SIFT-2D、FCSPPEval）分析颗粒亮度、浓度及组分比例。统计分析使用Student t检验、Welch t检验及Bonferroni-Holm校正。
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Libra 120 transmission electron microscope
Libra 120
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Used for electron microscopy to confirm fibril formation.
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Jasco 550 spectrometer
550
Jasco
Used for Congo red absorption spectra measurements.
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Jasco 810 spectropolarimeter
810
Jasco
Used for circular dichroism spectroscopy.
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Nanosizer ZSP
ZSP
Malvern Instruments
Used for dynamic light scattering to confirm vesicle size.
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Insight Reader
Evotec Technologies
Used for single molecule spectroscopy and SIFT measurements to analyze lipid binding and oligomer formation.
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FLUOStar OPTIMA plate reader
BMG Labtech
Used to monitor ThT fluorescence for fibril formation kinetics.
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Eppendorf Thermomixer Comfort
Comfort
Eppendorf
Used for incubating samples with shaking for fibril formation.
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Ti-tip sonifier
Bandelin
Used for sonication to prepare small unilamellar vesicles.
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High Performance Particle Sizer
Malvern Instruments
Used for dynamic light scattering to confirm vesicle size.
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Alexa Fluor-647-O-succinimidylester
Thermo Fisher Scientific
Fluorescent dye for labeling aSyn proteins.
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Bodipy-PE
Invitrogen
Green fluorescent lipid dye incorporated into vesicles.
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DPPC
Avanti Polar Lipids
Lipid used to prepare small unilamellar vesicles for binding studies.
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Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix
Thermo Fisher Scientific
Used for site-directed mutagenesis PCR.
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PD10 columns
PD10
Amersham Biosciences
Used for filtration to separate unbound fluorophores after labeling.
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