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一种结合红外成像的紫外交联方法用于分析RNA-蛋白质相互作用
摘要： 蛋白质与短RNA寡聚体的光交联是研究RNA-蛋白质相互作用的经典方法，这些相互作用涉及RNA代谢和功能的多个方面。最常用的方法是采用[γ-32P]标记的RNA探针。尽管灵敏度极高，但这些操作因放射性同位素的使用存在安全隐患而变得复杂。本文描述了一种改良的紫外光交联方法，使用末端标记红外染料IRDye? 800的寡核苷酸探针。紫外光交联后，通过SDS-PAGE分离蛋白质，并利用Odyssey?红外成像系统检测交联产物。这种末端标记法简化了随机标记流程（后者会降低体外转录效率），且不受探针长度影响，便于进行定量比较。为验证该方法，我们确认了HuD蛋白与微管相关蛋白tau mRNA的3'非翻译区结合（该蛋白与阿尔茨海默病发病机制相关）。分别使用重组纯化的谷胱甘肽-S-转移酶-HuD融合蛋白及转染HuD cDNA的CHO细胞裂解物，成功实现了HuD与标记21聚体探针的紫外光交联。紫外光交联结合红外成像技术，为分析RNA-蛋白质相互作用及其在疾病中的新兴重要性提供了便捷可靠的策略。
关键词： Tau蛋白、RNA结合蛋白、紫外线交联、神经退行性疾病、HuD蛋白、OdysseyVR
更新于2025-09-23 15:19:57
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RNA-蛋白质紫外交联实验
摘要： RNA-蛋白质相互作用在RNA代谢的各个方面都起着至关重要的作用，也在转录后基因调控中扮演主要角色。RNA结合蛋白与病毒基因表达（Ray和Das，2002）及microRNA介导的基因调控（Poria等，2016）有关。本文描述了一种方案：(1)通过紫外线交联共价连接瞬时相互作用的RNA-蛋白质复合物；(2)通过RNase消化去除未受保护的RNA；(3)通过SDS-PAGE分析检测RNA-蛋白质复合物。该方案提供了一种快速可靠的方法，可直接测定纯化蛋白的RNA-蛋白质相互作用及其动力学，并有助于发现新的RNA-蛋白质相互作用。
关键词： 紫外光交联、RNA-蛋白质相互作用、RNA结合蛋白
更新于2025-09-04 15:30:14