研究目的
开发并测试一种基于供体分子光开关特性来测量细胞内FRET的方法，该方法相比FLIM和pbFRET等现有技术具有优势。
研究成果
psFRET是一种可行的FRET成像替代方案，它兼具FLIM的优势但更易实现。该方法允许重复测量且可使用非荧光受体。通过多种构建体和应用验证了该方法的可靠性，不过长期研究可能需要对周期依赖性动力学进行校正。
研究不足
该方法需要拟合衰减曲线，这可能较为复杂。光开关动力学取决于光照强度，而光照或样品环境的不均匀性会影响结果。使用可光开关供体会限制荧光团的选择，且Dronpa在循环过程中光开关动力学的改变可能在延时实验中引入伪影。
1：实验设计与方法选择：
本研究通过光开关荧光蛋白（如供体Dronpa）和受体（如mCherry或Ultramarine）测试psFRET技术。该方法通过监测供体在有无受体存在时的光开关动力学来计算FRET效率。
2：样本选择与数据来源：
将COS 7细胞转染不同连接子的荧光蛋白串联二聚体构建体（如Dronpa-mCherry），并进行成像。对照样本包括单独供体和单独受体。
3：实验设备与材料清单：
使用配备特定激光器、物镜、相机和图像分离器的自制显微镜。采用荧光蛋白（Dronpa、mCherry、Ultramarine）及细胞培养材料（如DMEM-HG培养基、胎牛血清）。
4：实验流程与操作步骤：
在488纳米激发光下成像以监测供体光开关关闭过程，间隔采集图像。通过受体光漂白进行对比实验。使用ImageJ插件进行曲线拟合和FRET效率计算分析数据。
5：数据分析方法：
将光开关衰减曲线拟合至指数方程确定速率常数。通过推导公式计算FRET效率，并开展敏化发射分析和逐像素拟合。
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Sapphire laser
488 nm
Coherent, Inc.
Excitation source for donor fluorescence and photoswitching.
-
Sapphire laser
568 nm
Coherent, Inc.
Excitation source for acceptor fluorescence and photobleaching.
-
Dichroic mirror
Di03-R405/488/561/635
Semrock
Direct excitation light to the objective.
-
EMCCD camera
897
Andor Technology Corp.
Detection of fluorescence signals.
-
Camera
PCO Edge 4.2 LT
PCO AG
Detection of fluorescence signals.
-
Power sensor
S170C
Thorlabs, Inc.
Measurement of laser power levels.
-
LaserBoxx
405-nm
Oxxius
Excitation source for photoswitching and imaging.
-
AOTF
Gooch & Housego PLC
Control of laser lines for excitation.
-
Objective lens
100× 1.4 N.A. Plan-Apo
Nikon
Microscopy imaging with high magnification and numerical aperture.
-
Objective lens
40× 1.0 N.A. Oil Plan-Apo
Nikon
Microscopy imaging with moderate magnification.
-
Microscope
TE2000
Nikon
Platform for fluorescence imaging experiments.
-
Dual-View image splitter
Photometrics
Simultaneous collection of green and red emission signals.
-
Optical fiber
Andor Technology Corp.
Direction of laser beams to the microscope.
-
Cell culture dish
Delta-T
Bioptechs
Cultivation of COS 7 cells for experiments.
-
DMEM-HG medium
Invitrogen, Life Technologies
Cell culture medium.
-
Glutamax
Invitrogen
Supplement for cell culture medium.
-
Sodium pyruvate
Invitrogen
Supplement for cell culture medium.
-
FBS
Invitrogen
Serum for cell culture medium.
-
Transfection reagent
XtremeGene HP
Roche
Transfection of plasmids into COS 7 cells.
-
PCR enzyme
Phusion
New England Biolabs
PCR for plasmid construction.
-
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